Determinación de la composición de aminoácidos en una proteína.

 

El primer paso en la determinación de la estructura primaria de una proteína es identificar la cantidad de los aminoácidos que la constituyen. Para esto, se debe utilizar una muestra que contenga solamente a la proteína en cuestión, labor muy difícil si se toma en cuenta la inmensa cantidad de proteínas que hay en una sola célula. A la muestra que debe usarse para este análisis  se le denomina pura.

 

 

Hidrólisis ácida.

 

 

El polipéptido a analizar es primeramente hidrolizado con un ácido fuerte a 110 °C por aproximadamente 24 h. Este tratamiento rompe los enlaces peptídicos y libera a los aminoácidos. A partir de este tratamiento, los aminoácidos con cadenas laterales básicas, se liberan como sus  ácidos conjugados (aspartato y glutamato) y el triptofano se destruye casi completamente.

 

 

Cromatografía.

 

 

          Los aminoácidos individuales obtenidos por la hidrólisis ácida de la proteína, se separan por medio de una cromatografía de intercambio catiónico. En este método la mezcla de aminoácidos es aplicada a una columna que contiene una resina a la cual está unido fuertemente un grupo cargado negativamente (si estuviese unido un grupo cargado positivamente, la cromatografía sería de intercambio aniónico). Cada tipo de aminoácido es liberado de la columna al eluir una solución de fuerza iónica y pH mayor a la anterior. A medida que el pH se incrementa, los aminoácidos pierden a sus protones ionizables primero de su grupo a-carboxilo, luego de las cadenas laterales y finalmente de los grupos amino, de tal manera que se transforman en moléculas neutras, luego a medida que adquieren carga negativa son liberados de la resina de la columna. Cada aminoácido emerge de la columna a un pH determinado:

 

 

 

mezcla de                           aminoácidos            solución de fuerza iónica

aminoácidos                     unidos a la resina              y pH controlado

 

resina                                           G

aniónica                                   A   V                                L   M

                                               L   M                                P   F

cargas                                                                            P   F

negativas                                                                        W  S

                                               T   N

 

 

Aminoácidos liberados:          GG

AA

V V

 

Figura: representación del funcionamiento de una resina cromatográfica de intercambio catiónico.

 

 

Análisis cuantitativo.

 

 

          Los aminoácidos separados contenidos en el eluido de la columna son cuantificados al calentarlos en presencia de ninhidrina; este compuesto forma un complejo púrpura con la mayoría de los aminoácidos, el amoniaco y aminas (forma por el contrario un complejo amarillo con el grupo imida de la prolina). La cantidad de cada uno de los aminoácidos se determina espectrofotométricamente al medir la cantidad de luz absorbida por el derivado de la ninhidrina. La absorbencia de cada uno de los derivados de aminoácido es capturada por una computadora. Cada pico analizado corresponde a un tipo de aminoácido; el área bajo la curva de cada uno de los picos obtenidos es directamente proporcional a la cantidad de derivado de aminoácido presente en la proteína original. Si se conoce el peso molecular de la proteína, se puede reportar la cantidad de cada uno de los tipos de aminoácido por mol de proteína; si no se sabe este valor entonces se reportará únicamente la relación. Este análisis comúnmente se realiza con un secuenciador de aminoácidos que es una máquina que puede hacer el procedimiento automáticamente.

 

 

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Dr. Edgar Vázquez-Contreras

Instituto de Química, UNAM

 

 

 

 

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Última actualización: 20 de Septiembre de 2003

 

 

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