Secuencias especificas de ADN pueden ser amplificadas (reacción en cadena de la polimerasa PCR)

 

 

La estrategia para secuenciar un genoma completo conlleva a la fabricación de librerías genéticas. El proceso se facilita cuando se quiere aislar un gen y se conocen al menos algunas partes de él (por ejemplo la secuencia amino o carboxilo de la proteína para la que codifica), lo cual reduce el número de copias de segmentos de ADN que deben ser amplificados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR del inglés). Esta reacción fue utilizada por primera vez por Kary Mullis en 1983. El ADN amplificado puede ser clonado directamente o usado en una gran variedad de procedimientos analíticos (ej. southern blot)

 

El PCR es en si un técnica muy simple: dos oligonucleotidos son sintetizados cada uno como secuencia complementaria de una hebra opuesta (secuencia de un segmento en cada una de las hebras) del ADN blanco en posiciones que estén mas allá de aquellas donde termina el segmento a ser amplificado. Los oligonucleotidos sirven como cebadores con sus extremos 3' orientados en direcciones opuestas.

 

El ADN  aislado que contiene el segmento a ser amplificado es calentado levemente para ser desnaturalizado (separado en hebras sencillas), después se enfría en presencia de grandes cantidades de los oligonucleotidos sintéticos, lo que permite que por hibridización, se encuentren las secuencias complementarias. En este momento se agregan los cuatro desoxiribonucleotidos trifosfato y el segmento hibridizado sirve como cebador para iniciar la amplificación. El proceso de calentamiento y enfriamiento se lleva a cabo unas 25-30 veces en algunas horas en un aparato que lo hace automáticamente, hasta que el fragmento puede ser analizado o clonado.

 

Los segmentos son amplificados utilizando una ADN polimerasa resistente a los cambios de temperatura como la TaqI polimerasa (aislada de una bacteria hipertermófila). Si se diseñan con cuidado los cebadores de tal forma que contengan sitios de corte para endonucleasas, se puede facilitar mucho la clonación del ADN amplificado.

 

Con esta técnica se han podido amplificar segmentos de ADN de 40,000 años de antigüedad como momias humanas y animales extintos como el mamut, lo que ha dado origen a la arqueología molecular y a la paleontología molecular. Se utiliza mucho esta técnica para rastrear el origen de los virus humanos y en estudios forenses (southern blot).

 

 

 

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Dr. Edgar Vázquez-Contreras

Instituto de Química, UNAM

 

 

 

 

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Última actualización: 14 de Octubre de 2003

 

 

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