La
triosafosfato isomerasa (TPI o TIM) cataliza la interconversión del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO y
DIHIDROXIACETONAFOSFATO. Esta reacción es la quinta de la glucólisis y la
última de primera etapa de este proceso. La TPI, se ha encontrado en todas las
especies analizadas hasta la fecha, y actualmente se conoce la secuencia de aminoácidos de la TPI de »50
especies y la estructura tridimensional de 8 de ellas (pollo, levadura Trypanosoma brucei,
Trypanosoma cruzi, E. coli ,
Bacillus stearothermophilus,
Plasmodium falciparium, E. histolytica y humano).
Sólo uno de los
productos de la catálisis de la aldolasa, el
GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO, continúa a lo largo de la vía glucolítica.
La DIHIDROXIACETONAFOSFATO y el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO son isómeros cetosa-aldosa exactamente igual
que la FRUCTOSA-6-FOSFATO y la GLUCOSA-6-FOSFATO. Las concentraciones de
GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO y DIHIDROXIACETONAFOSFATO se mantienen en la célula en
una relación de (GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO / DIHIDROXIACETONAFOSFATO) de 0.473,
existe más DIHIDROXIACETONAFOSFATO que GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO; sin embargo,
debido a que el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO se consume en la siguiente reacción,
la mayor parte de la DIHIDROXIACETONAFOSFATO se transforma en
GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO. La interconversión de GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO y
DIHIDROXIACETONAFOSFATO probablemente ocurra vía un intermediario enediol o enediolato, en analogía
a la reacción catalizada por la PGI en el paso dos de
la vía:
Gliceraldehído-3-Fosfato Intermediario Enediol Dihidroxiacetona
o Enediolato fosfato
Figura: representación de la reacción catalizada por la triosafosfato isomerasa.
Los números
verdes señalan el número de átomo
Evidencias
para soportar la anterior observación provienen de resultados obtenidos al
utilizar análogos del estado de transición, el fosfoglucohidroximato
y el 2-fosfoglicolato, que son compuestos estables
cuyas estructuras geométricas recuerdan la del intermediario enediol o enediolato propuesto:
Fosfoglucohidroximato 2-fosfoglicolato
Figura: análogos del estado de transición de la reacción catalizada por la TIM
La TPI cataliza las reacciones uniendo más fuertemente al estado
de transición que al substrato; de hecho el 2-fosfoglicolato
se une de 100 a 155 veces con más afinidad a la TPI que el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO
o DIHIDROXIACETONAFOSFATO. De ahí que estas moléculas sean fuertes inhibidores
de la enzima
Por otra parte
se, conocen los rearreglos estructurales que se
llevan a cabo en presencia de diversos análogos del substrato. Todas las enzimas
analizadas, son dímeros formados por dos cadenas idénticas de aproximadamente
27 kDa. Los parámetros cinéticos de la enzima
proveniente de diferentes especies son
semejantes. No se han descrito cofactores o reguladores alostéricos,
ni se ha detectado cooperatividad entre las subunidades
y la actividad de los sitios es
independiente. Por medio de técnicas de ingeniería genética, se construyó una
variante monómerica a partir de la TPI de Trypanosoma brucei, a la cual se ha denominado como monoTIM. Esta molécula, es capaz de unir al substrato y
catalizar la reacción, sin embargo,
manifiesta una disminución de 20 veces con respecto a la enzima nativa
en la Km y de
1000 veces en la kcat.
La
triosafosfato isomerasa, es una enzima muy eficiente,
la velocidad con que cataliza la isomerización del
GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO es entre 108
y 109 veces mayor que en ausencia de ésta. La relación kcat/Km para el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO como
substrato (La relación kcat/Km
representa la constante de velocidad aparente de segundo orden (v) de la reacción entre enzima libre ( [E] )
y substrato libre ([S]); v = (kcat/Km) [E][S]) es
de 108 M-1s-1; éste valor es comparable al calculado
(108-1010 M-1s-1)
para reacciones bimoleculares en solución
controladas por difusión. La reacción catalizada por
la TPI se lleva a cabo gracias a la formación de un intermediario cis-enediol(ato). Mecanísticamente, la
función biológica de esta enzima, consiste en
disminuir las barreras energéticas que limitan la velocidad de protonación y deprotonación de
los substratos y/o estabilizar el intermediario cis-enediol(ato).
El perfil de energía libre de la reacción que cataliza,
muestra que el estado de transición más alto es precisamente la unión del
GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO a la enzima. Gracias al estudio de los parámetros
catalíticos de la TPI variando la viscosidad del solvente, se ha confirmado por
una parte, que la unión del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO a la enzima está limitada
por la frecuencia de encuentros entre las dos especies, y por otra, que no se debe a los ajustes conformacionales que la
proteína desarrolla con el solvente para la catálisis o a los rearreglos químicos entre substrato y enzima. Por tanto, la
TPI es un catalizador "perfecto"; cualquier aumento en la
velocidad de los pasos catalíticos no tendría efecto en la velocidad de la
reacción. En varias enzimas (Gracias al estudios cinéticos variando la
viscosidad del solvente, se ha demostrado que la velocidad catalítica de las siguientes
enzimas: fosforilasa
b, peroxidasa
de rábano, quimotripsina, b-lactamasa, anhidrasa carbónica, invertasa, acetilcolinesterasa, y
adenosina desaminasa; está limitada por la difusión
del substrato hacia la enzima.), se ha encontrado que la difusión del
substrato, es el paso limitante para la catálisis. De tal forma, que el
recambio entre el agua de hidratación y el solvente, permite que la velocidad
con la que la capa de hidratación de la proteína se reajuste durante la
catálisis, y no sea un paso limitante durante los rearreglos
químicos entre la proteína y el substrato. Estos hechos han permitido la
evolución de mecanismos biológicos altamente eficientes.
El
mecanismo propuesto para la actividad catalítica de la triosafosfato isomerasa a partir de la combinación de estudios cinéticos,
genéticos y estructurales, en particular, la similitud de los valores obtenidos
para la dependencia de la catálisis de la TPI con el pH respecto a los
observados para la PGI, que denotan la presencia de dos pK´s uno de 6.5 y otro de 9.5, involucra un mecanismo
ácido-base. Pero, los estudios de la
variación de la catálisis con el pH no permiten por si mismos interpretar
cuáles son los residuos específicos que participan en la reacción; para
resolver la identidad de los mismos, se han utilizado compuestos de marcaje de
afinidad, tanto la bromohydroxiacetona fosfato como
el glicidol fosfato:
Bromohydroxiacetona
fosfato Glicidol fosfato
Figura: compuestos de marcaje de afinidad para la catálisis de la TIM.
que
inactivan a la TPI formando ésteres con el glutámico 165, cuyo grupo carboxilato, según lo indican estudios de cristalografía de
rayos X, está idealmente situado para remover el
protón del C2 del substrato. De hecho, el remplazo
del Glu 165 por Asp, lo
cual aleja el grupo carboxilato en »1Å resulta
en una reducción de la actividad catalítica de la enzima alrededor de 1000
veces.
Los estudios
cristalográficos de la enzima de levadura en complejo con fosfoglucohidroximato,
indican que la histidina 95 está unida por dos puentes de hidrógeno al la DIHIDROXIACETONAFOSFATO,
lo cual permite la protonación del oxígeno carbonílico del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO:
Figura: representación de los enlaces que se forman en el sitio activo de la TIM durante la catálisis.
Por otra
parte, estudios de resonancia magnética nuclear (NRM) indican que esta His 95 está en su forma neutral imidazol en vez de la forma imidazolio
protonada. Pero, ¿cómo un grupo imidazol
N3-H, el cual tiene un pK altamente
básico de »
14.0, protona
a un oxígeno carboxílico que cuando se protona tiene
un pK muy ácido de < 0? Y
del mismo modo, ¿cómo puede el carboxilato del Glu 165 (pK 6.5)
sustraer el protón del C2 (pK»17)
del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO?. Una posible explicación
es que el intercambio del protón esté
facilitado por la formación de una intensa barrera de puentes de
hidrógeno. Esta inusual asociación tan
fuerte (-40 a –80kJmol-1 vs –12 a -30kJmol-1
para puentes de hidrógeno “normales”) se forma cuando los pK´s del donador y aceptor son muy
parecidos.
Al convertir el
GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO al intermediario enediol (o enediolato), el pK
de la forma protonada de su oxígeno carbonílico, el cual se transforma en un hidroxilo, se
incrementa a »14.0,
lo cual concuerda con la neutralidad de la His 95. La
resultante barrera de puentes de hidrógeno entre este grupo hidroxilo y la His 95 permite que la cadena lateral imidazol
protone el átomo de oxígeno. De la misma forma, el
oxígeno carbonílico es protonado,
el pK del protón del C2 se reduce a »7.0,
valor cercano al pK del
carboxilato del Glu
165. Aparentemente, la reacción ocurre vía un simultáneo retiro del protón por
el Glu 165 y una protonación
por la His 95. La intensa barrera de puentes de
Hidrógeno postulada para explicar la formación del estado de transición, no el
complejo de Michaelis, entre el Glu
165 y el C2-H y entre la His 95 y el oxígeno carbonílico se piensa provee la estabilización necesaria
para catalizar la reacción. La cadena lateral cargada positivamente de la Lys 12, la cual es probablemente responsable del pK de 9.5 observado en el trazo de
catálisis vs pH de la
TPI (junto con el macrodipolo formado por dos a-hélices
una de ellas modifica el pK de la His 95, mientras
que el macrodipolo positivo de la otra hélice permite
la unión del fosfato del substrato), es la que estabiliza electrostáticamente
al estado de transición cargado negativamente. La conversión del enediol(ato)
a DIHIDROXIACETONAFOSFATO es facilitada por la formación de la intensa barrera
de puentes de Hidrógeno en el estado de
transición.
La estructura
secundaria de la TPI, está formada por ocho hebras b que
alternan con una (a veces dos) a hélice(s). La cadena se pliega de manera que las ocho
hebras forman una hoja b paralela central semejante a un barril (el
ángulo entre las hebras y el eje del
barril es de 35 0). Las hélices que unen a las hebras b se
empaquetan en forma paralela a la
dirección de las hebras. El sitio activo
se encuentra en uno de los extremos del barril, en la cavidad formada por las
asas contiguas a las hebras
b. Este
patrón topológico se ha encontrado en más de 20 enzimas con actividades
catalíticas diversas (aproximadamente el 10 % de las enzimas cristalizadas). No
es claro si este patrón de plegamiento refleja las características de un
ancestro común, o si el barril presenta una topología estable a la cual han
convergido diferentes enzimas
Existe una
presión evolutiva continua para modificar la cadena polipeptídica; las regiones
conservadas son aquellas que han resistido esta presión a lo largo de la evolución.
En proteínas homólogas, las regiones que se encuentran en el sitio activo están conservadas, así
como los residuos directamente involucrados en la química de la reacción. Este
es el caso de la TPI, los aminoácidos conservados son aquellos que participan
directamente en la química de la reacción, o se localizan en la vecindad del
sitio activo. A pesar de las diferencias en los aminoácidos de la interfase, la
topología del barril y la geometría de la asociación de los monómeros en el
dímero, es semejante en diferentes especies.
La comparación
de la estructura de la TPI con el
complejo TPI-fosfohidroximato revela que cuando el
substrato de une una asa (loop) conservado de 10
residuos se cierra (se conoce como asa
catalítica o flexible), sobre el sitio activo como una bisagra, lo que implica
el movimiento de cadenas laterales en »7.0Å. Un segmento de cuatro
residuos de esta asa hace puentes de hidrógeno con el fosfato del
substrato. Retirar mutagénicamente
a estos 4 residuos no deforma significativamente a la enzima, por tanto la
unión del substrato no es severamente afectada, pero la velocidad de la
catálisis se reduce 105 veces y une muy débilmente al fosfoglucohidroximato. Evidentemente, el hecho de que el
asa se cierre sobre el sitio activo, preferencialmente
estabiliza la reacción para la formación del estado de transición.
El cierre del
asa también provee un ejemplo de control estereoelectrónico
de la enzima en la reacción. En solución el intermediario enediol
se descompone para formar el compuesto tóxico metilglioxal por la eliminación
del fosfato del C3:
Metil glioxal
Figura: representación de la molécula de metil glioxal.
En la
superficie de la enzima, esta reacción no sucede porque el grupo fosfato es
detenido por el asa flexible en el plano del intermediario enediol,
posición que es desfavorable para la eliminación del fosfato. En una mutante que carece del asa
flexible, el enediol tiene posibilidades de salir del
sitio catalítico, aproximadamente el 85% es liberado, el cual rápidamente se
convierte en metil glioxal
y fosfato.
A la fecha, no es todavía claro
el por qué la TPI sólo es activa como dímero, ya que los aminoácidos
involucrados en la catálisis se encuentran contenidos en el monómero. Es
probable que las interacciones en la interfase sean necesarias para mantener a los aminoácidos catalíticos en una
posición adecuada, o para mantener la
estabilidad de la estructura de barril; de hecho, un número de
aminoácidos de la interfase se encuentran conservados. Sin embargo, algunos miembros de la
familia de proteínas a/b son
barriles activos como monómeros.
Para ver la
estructura tridimensional de la triosafosfato isomerasa
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