Triosafosfato isomerasa

 

La triosafosfato isomerasa (TPI o TIM) cataliza la interconversión del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO y DIHIDROXIACETONAFOSFATO. Esta reacción es la quinta de la glucólisis y la última de primera etapa de este proceso. La TPI, se ha encontrado en todas las especies analizadas hasta la fecha, y actualmente se conoce  la secuencia de aminoácidos de la TPI de »50 especies y la estructura tridimensional de 8 de ellas (pollo, levadura  Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, E. coli , Bacillus stearothermophilus, Plasmodium falciparium, E. histolytica y humano).

 

Sólo uno de los productos de la catálisis de la aldolasa, el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO, continúa a lo largo de la vía glucolítica. La DIHIDROXIACETONAFOSFATO y el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO son isómeros cetosa-aldosa exactamente igual que la FRUCTOSA-6-FOSFATO y la GLUCOSA-6-FOSFATO. Las concentraciones de GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO y DIHIDROXIACETONAFOSFATO se mantienen en la célula en una relación de (GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO / DIHIDROXIACETONAFOSFATO) de 0.473, existe más DIHIDROXIACETONAFOSFATO que GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO; sin embargo, debido a que el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO se consume en la siguiente reacción, la mayor parte de la DIHIDROXIACETONAFOSFATO se transforma en GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO. La interconversión de GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO y DIHIDROXIACETONAFOSFATO probablemente ocurra vía un intermediario enediol o enediolato, en analogía a la reacción catalizada por la PGI en el paso dos de la vía:

 

 

 

Gliceraldehído-3-Fosfato         Intermediario Enediol                      Dihidroxiacetona

o Enediolato                                     fosfato   

 

Figura: representación de la reacción catalizada por la triosafosfato isomerasa.

Los números verdes señalan el número de átomo

 

 

Evidencias para soportar la anterior observación provienen de resultados obtenidos al utilizar análogos del estado de transición, el fosfoglucohidroximato y el 2-fosfoglicolato, que son compuestos estables cuyas estructuras geométricas recuerdan la del intermediario enediol o enediolato propuesto:

 

 

Fosfoglucohidroximato                                 2-fosfoglicolato

 

Figura: análogos del estado de transición de la reacción catalizada por la TIM

 

 

La TPI cataliza las reacciones uniendo más fuertemente al estado de transición que al substrato; de hecho el 2-fosfoglicolato se une de 100 a 155 veces con más afinidad a la TPI que el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO o DIHIDROXIACETONAFOSFATO. De ahí que estas moléculas sean fuertes inhibidores de la enzima

 

Por otra parte se, conocen los rearreglos estructurales que se llevan a cabo en presencia de diversos análogos del substrato. Todas las enzimas analizadas, son dímeros formados por dos cadenas idénticas de aproximadamente 27 kDa. Los parámetros cinéticos de la enzima proveniente de diferentes especies  son semejantes. No se han descrito cofactores o reguladores alostéricos, ni se ha detectado cooperatividad entre  las subunidades y  la actividad de los sitios es independiente. Por medio de técnicas de ingeniería genética, se construyó una variante monómerica a partir de la TPI  de Trypanosoma brucei, a la cual se ha denominado como monoTIM. Esta molécula, es capaz de unir al substrato y catalizar la reacción, sin embargo,  manifiesta una disminución de 20 veces con respecto a la enzima nativa en la Km y de 1000 veces en la kcat.

 

La triosafosfato isomerasa, es una enzima muy eficiente, la velocidad con que cataliza la isomerización del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO es  entre 108 y 109 veces mayor que en ausencia de ésta. La relación kcat/Km  para el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO como substrato (La relación kcat/Km representa la constante de velocidad aparente de segundo orden  (v) de la reacción entre enzima libre ( [E] ) y  substrato libre ([S]);  v = (kcat/Km) [E][S]) es de  108 M-1s-1;  éste valor es comparable al calculado (108-1010 M-1s-1)  para reacciones bimoleculares en solución controladas por difusión. La reacción catalizada por la TPI se lleva a cabo gracias a la formación de un intermediario cis-enediol(ato). Mecanísticamente, la función biológica de esta enzima, consiste en  disminuir las barreras energéticas que limitan la velocidad de protonación y deprotonación de los substratos y/o estabilizar el intermediario cis-enediol(ato). El perfil de energía libre de la reacción que cataliza, muestra que el estado de transición más alto es precisamente la unión del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO a la enzima. Gracias al estudio de los parámetros catalíticos de la TPI variando la viscosidad del solvente, se ha confirmado por una parte, que la unión del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO a la enzima está limitada por la frecuencia de encuentros entre las dos especies,  y por otra, que no se debe a los ajustes conformacionales que la  proteína desarrolla con el solvente para la catálisis o a los rearreglos químicos entre substrato y enzima. Por tanto, la TPI es un catalizador "perfecto"; cualquier aumento en la velocidad de los pasos catalíticos no tendría efecto en la velocidad de la reacción. En varias enzimas (Gracias al estudios cinéticos variando la viscosidad del solvente, se ha demostrado que la  velocidad catalítica de las siguientes enzimas: fosforilasa  b,  peroxidasa de rábano, quimotripsina, b-lactamasa, anhidrasa carbónica, invertasa, acetilcolinesterasa, y adenosina desaminasa; está limitada por la difusión del substrato hacia la enzima.), se ha encontrado que la difusión del substrato, es el paso limitante para la catálisis. De tal forma, que el recambio entre el agua de hidratación y el solvente, permite que la velocidad con la que la capa de hidratación de la proteína se reajuste durante la catálisis, y no sea un paso limitante durante los rearreglos químicos entre la proteína y el substrato. Estos hechos han permitido la evolución de mecanismos biológicos altamente eficientes.

 

          El mecanismo propuesto para la actividad catalítica de la triosafosfato isomerasa a partir de la combinación de estudios cinéticos, genéticos y estructurales, en particular, la similitud de los valores obtenidos para la dependencia de la catálisis de la TPI con el pH respecto a los observados para la PGI, que denotan la presencia de dos pK´s  uno de 6.5 y otro de 9.5, involucra un mecanismo ácido-base.  Pero, los estudios de la variación de la catálisis con el pH no permiten por si mismos interpretar cuáles son los residuos específicos que participan en la reacción; para resolver la identidad de los mismos, se han utilizado compuestos de marcaje de afinidad, tanto la bromohydroxiacetona fosfato como el glicidol fosfato:

 

 

Bromohydroxiacetona fosfato                          Glicidol fosfato

 

Figura: compuestos de marcaje de afinidad para la catálisis de la TIM.

 

 

que inactivan a la TPI formando ésteres con el glutámico 165, cuyo grupo carboxilato, según lo indican estudios de cristalografía de rayos X,  está idealmente situado para remover el protón del C2 del substrato. De hecho, el remplazo del Glu 165 por Asp, lo cual aleja el grupo carboxilato en »1Å resulta en una reducción de la actividad catalítica de la enzima alrededor de 1000 veces.

 

Los estudios cristalográficos de la enzima de levadura en complejo con fosfoglucohidroximato, indican que la histidina 95 está unida por dos puentes de hidrógeno al la DIHIDROXIACETONAFOSFATO, lo cual permite la protonación del oxígeno carbonílico del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO:

 

 

 

Figura: representación de los enlaces que se forman en el sitio activo de la TIM durante la catálisis.

 

 

Por otra parte, estudios de resonancia magnética nuclear (NRM) indican que esta His 95 está en su forma neutral imidazol  en vez de la forma imidazolio protonada. Pero, ¿cómo un grupo imidazol N3-H, el cual tiene un pK altamente básico de » 14.0,  protona a un oxígeno carboxílico que cuando se protona tiene un pK muy ácido de < 0? Y del mismo modo, ¿cómo puede el carboxilato del Glu 165 (pK 6.5) sustraer el protón del C2 (pK»17) del GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO?. Una posible explicación es que  el intercambio del protón esté facilitado por la formación de una intensa barrera de puentes de hidrógeno.  Esta inusual asociación tan fuerte (-40 a –80kJmol-1 vs –12 a -30kJmol-1 para puentes de hidrógeno “normales”) se forma cuando los pK´s del donador y aceptor son muy parecidos.

 

Al convertir el GLICERALDEHÍDO-3-FOSFATO al intermediario enediol (o enediolato), el pK de la forma protonada de su oxígeno carbonílico, el cual se transforma en un hidroxilo, se incrementa a »14.0, lo cual concuerda con la neutralidad de la His 95. La resultante barrera de puentes de hidrógeno entre este grupo hidroxilo y la His 95 permite que la cadena lateral imidazol protone el átomo de oxígeno. De la misma forma, el oxígeno carbonílico es protonado, el pK del protón del C2 se reduce a »7.0, valor cercano al pK  del  carboxilato del Glu 165. Aparentemente, la reacción ocurre vía un simultáneo retiro del protón por el Glu 165 y una protonación por la His 95. La intensa barrera de puentes de Hidrógeno postulada para explicar la formación del estado de transición, no el complejo de Michaelis, entre el Glu 165 y el C2-H y entre la His 95 y el oxígeno carbonílico se piensa provee la estabilización necesaria para catalizar la reacción. La cadena lateral cargada positivamente de la Lys 12, la cual es probablemente responsable del pK de 9.5 observado en el trazo de catálisis vs pH de la  TPI (junto con el  macrodipolo formado por dos a-hélices una de ellas modifica el pK de la His 95, mientras que el macrodipolo positivo de la otra hélice permite la unión del fosfato del substrato), es la que estabiliza electrostáticamente al estado de transición cargado negativamente. La conversión del enediol(ato) a DIHIDROXIACETONAFOSFATO es facilitada por la formación de la intensa barrera de puentes de Hidrógeno  en el estado de transición.

 

La estructura secundaria de la TPI, está formada por ocho hebras b que alternan con una (a veces dos) a hélice(s). La cadena se pliega de manera que las ocho hebras forman una hoja  b  paralela central semejante a un barril (el ángulo entre las hebras  y el eje del barril es de 35 0). Las hélices que unen a las hebras b se empaquetan en forma  paralela a la dirección de las hebras.  El sitio activo se encuentra en uno de los extremos del barril, en la cavidad formada por las asas  contiguas a las hebras b. Este patrón topológico se ha encontrado en más de 20 enzimas con actividades catalíticas diversas (aproximadamente el 10 % de las enzimas cristalizadas). No es claro si este patrón de plegamiento refleja las características de un ancestro común, o si el barril presenta una topología estable a la cual han convergido  diferentes enzimas

 

Existe una presión evolutiva continua para modificar la cadena polipeptídica; las regiones conservadas son aquellas que han resistido esta presión a lo largo de la evolución. En proteínas homólogas, las regiones que se encuentran  en el sitio activo están conservadas, así como los residuos directamente involucrados en la química de la reacción. Este es el caso de la TPI, los aminoácidos conservados son aquellos que participan directamente en la química de la reacción, o se localizan en la vecindad del sitio activo. A pesar de las diferencias en los aminoácidos de la interfase, la topología del barril y la geometría de la asociación de los monómeros en el dímero, es semejante en diferentes especies.

 

La comparación de la estructura de la TPI  con el complejo TPI-fosfohidroximato revela que cuando el substrato de une una asa (loop) conservado de 10 residuos  se cierra (se conoce como asa catalítica o flexible), sobre el sitio activo como una bisagra, lo que implica el movimiento de cadenas laterales en »7.0Å. Un segmento de cuatro residuos de esta asa hace puentes de hidrógeno con el fosfato del substrato.  Retirar mutagénicamente a estos 4 residuos no deforma significativamente a la enzima, por tanto la unión del substrato no es severamente afectada, pero la velocidad de la catálisis se reduce 105 veces y une muy débilmente al fosfoglucohidroximato. Evidentemente, el hecho de que el asa se cierre sobre el sitio activo, preferencialmente estabiliza la reacción para la formación del estado de transición.

 

El cierre del asa también provee un ejemplo de control estereoelectrónico de la enzima en la reacción. En solución el intermediario enediol se descompone para formar el compuesto tóxico metilglioxal por la eliminación del fosfato del C3:

 

 

Metil glioxal

 

Figura: representación de la molécula de metil glioxal.

 

 

En la superficie de la enzima, esta reacción no sucede porque el grupo fosfato es detenido por el asa flexible en el plano del intermediario enediol, posición que es desfavorable para la eliminación del fosfato. En una mutante que carece del asa flexible, el enediol tiene posibilidades de salir del sitio catalítico, aproximadamente el 85% es liberado, el cual rápidamente se convierte en metil glioxal y fosfato.

 

A la fecha, no es todavía claro el por qué la TPI sólo es activa como dímero, ya que los aminoácidos involucrados en la catálisis se encuentran contenidos en el monómero. Es probable que las interacciones en la interfase sean necesarias para  mantener a los aminoácidos catalíticos en una posición adecuada, o para mantener la  estabilidad de la estructura de barril; de hecho, un número de aminoácidos de la interfase se encuentran conservados.  Sin embargo, algunos miembros de la familia  de proteínas a/b son barriles activos como monómeros.

 

Para ver la estructura tridimensional de la triosafosfato isomerasa

 

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Dr. Edgar Vázquez-Contreras

Instituto de Química, UNAM

 

 

 

 

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Última actualización: 15 de Octubre de 2003

 

 

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